青霉素的生产工艺

青霉素是人类早发现的抗生素,其杀伤革兰氏阳性细菌的神奇功效几乎人人都曾领教过。本文将对青霉素的生产工艺及其提取进行深入的讲解。

  一、前言

青霉素又被称为青霉素G、盘尼西林、配尼西林、青霉素钠、苄青霉素钠、青霉素钾、苄青霉素钾。青霉素是抗菌素的一种,是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素,是种能够治疗人类疾病的抗生素。青霉素类抗生素是β-内酰胺类中一大类抗生素的总称。1929年英国学者弗莱明首先在抗生素中发现了青霉素,英国谢菲尔德大学病理学家弗洛里实现对青霉素的分离与纯化,并发现其对传染病的疗效,与英国生物化学家钱恩共获1945年诺贝尔奖。青霉素分为天然的和半合成的,天然的青霉素是通过菌种发酵得到的。本文在简述青霉素作用的基础上,对发酵法生产青霉素的工艺流程和精制提取青霉素进行详细的讲解。

二、青霉素的生物学特性

青霉素类抗生素是β-内酰胺类中一大类抗生素的总称,由于β-内酰胺类作用于细菌的细胞壁,而人类只有细胞膜无细胞壁,故对人类的毒性较小,除能引起严重的过敏反应外,在一般用量下,其毒性不甚明显,但它不能耐受耐药菌株(如耐药金葡)所产生的酶,易被其破坏,且其抗菌谱较窄,主要对革兰氏阳性菌有效。青霉素G有钾盐、钠盐之分,钾盐不仅不能直接静注,静脉滴注时,也要仔细计算钾离子量,以免注入人体形成高血钾而抑制心脏功能,造成死亡。

三、青霉素生长菌

青霉素初是从点青霉素产生,生产能力很低,后来找到适于深层培养的产黄青霉菌,经一系列的诱变、杂交、育种,才得到高产的菌种。目前国内青霉素的生产菌种按菌丝的形态分为丝状菌和球状菌两种。丝状菌和球状菌对原材料和培养条件的要求有一定的差别,产生青霉素的能力也有差异。球状菌的发酵单位虽高,但对原材料和设备要求较高,且提炼收率也低于丝状菌,因此国内青霉菌生产厂大都采用绿色丝状菌。

  四、青霉素的发酵

青霉素的发酵属于次级代谢产物发酵,发酵过程一般分为菌体生长、产物合成和菌体自溶三个阶段。

在菌体生长阶段,碳源和氮源等被分解代谢,浓度明显下降,菌体进行合成代谢。随着菌体浓度的不断增加,摄氧率也不断增大,溶氧浓度不断下降。当菌体生长进入稳定期时,菌体浓度降至小。当营养物质降到一定水平时,其中某一参数可能成为菌体生长的限制性因数,使菌体生长速率减慢。同时,在大量合成菌体期间,积累了相当量的某些代谢中间体,原有酶的活力下降,出现了与次级代谢有关的酶或其酶被解除了控制,导致菌体的生理状况发生改变,发酵就从菌体生长阶段转入产物合成阶段。这个阶段一般称为菌体生长期或发酵前期。

在产物合成阶段,产物的生成量逐渐增多,直至达到高峰,生产速率也达到大,直至产物合成能力减退。在这个阶段,菌体的呼吸强度一般无显著变化,菌体物质的合成仍未停止,菌体的质量有所增加,但此时菌体细胞基本不繁殖。这个阶段的代谢变化是以碳源和氮源的分解代谢和产物的合成代谢为主,碳、氢等营养物质不断被消耗,产物不断被合成。外界的环境变化很容易影响这个阶段的代谢。碳源、氮源和磷酸盐等的浓度必须控制在一定的范围内,发酵条件也要严格控制,才能促使产物不断被合成。

在菌体自溶阶段,菌体开始衰老,细胞开始自溶,培养基中碳、氮含量增加,PH上升,产物合成能力衰退,生产速率下降。发酵到此必须结束,否则产物不仅受到破坏,还会因菌体自溶而给发酵液的过滤和提取带来困难。

青霉素生产菌不同,发酵工业也有区别。

丝状菌的青霉素发酵工艺流程:沙土管→斜面母瓶(孢子培养,25℃,6~7d)→大米孢子斜面(孢子培养,25℃,6~7d)→种子罐(种子培养,25℃,40~45h)→繁殖罐(种子培养,25℃,13~15h)→发酵罐(发酵,26℃,6~7d)→放罐

球状菌的青霉素发酵工艺流程:冷冻管→斜面母瓶(孢子培养,25℃,6~8d)→大米孢子斜面(孢子培养,25℃,8~10d)→种子罐(种子培养,28℃,50~60h)→发酵罐(发酵,26℃,6~7d)→放罐

青霉素的分批发酵分为菌丝生长和产物合成两个阶段,进入合成阶段的必要条件是降低菌丝的生长速率。影响青霉素发酵产率的因素有环境和生理因素两个方面,前者包括温度、PH、培养基种类及浓度、溶解氧饱和度等;后者包括菌体浓度、菌体生长速率、菌丝形态等。

菌体生长和青霉素合成适温度并不相同,一般前阶段略高于后阶段。因此,在菌体生长阶段可以采取较高温度,以缩短生长时间,而到达产物合成阶段,应适当降低温度,以利于青霉素的合成。青霉素发酵的适PH一般在6.5左右,由

于青霉素在碱性条件下不稳定,容易发生水解,因此应尽量避免PH超过7.0。

五、青霉素的提取

1、发酵液预处理

发酵液预处理是抗生素分离纯化的道工序。发酵结束后,发酵液中抗生素的浓度通常很低,而杂质的含量通常很高,包括有大量的菌体细胞、未用完的培养基、各种蛋白质胶状物以及其他代谢产物等。发酵液预处理主要去除两大类物质:一类是可溶性物质,包括核酸、杂蛋白质、不溶性多糖等,这些杂质不仅使发酵液粘度提高,影响液固分离速率,而且还会影响提取操作;另一类是某些无机盐,它们不仅影响成品质量,而且在采用离子交换法提取时,由于树脂大量吸附无机离子而减少对抗生素的交换,因此,应将这些无机离子,特别是高价金属离子除去。

发酵液放罐后,首先要冷却,因为青霉素在低温时比较稳定,细菌繁殖也比较慢,可避免青霉素迅速被破坏。青霉素菌丝教粗,一般过滤较容易,通常采用鼓式过滤及板框过滤;蛋白质的处理方法包括等电点沉淀、变性沉淀、沉淀剂沉淀、凝聚剂沉淀、絮凝剂沉淀;吸附、酶解法去除不溶性多糖等;高价金属离子的去除方法有离子交换法和沉淀法等。

2、青霉素的提取

青霉素的提取方法包括离子交换法、吸附法、沉淀法和溶剂萃取法等。离子交换法利用离子交换树脂作为吸附剂,将青霉素从发酵液中吸着在树脂上,然后在适宜的条件下洗脱下来,达到分离、浓缩、提纯的目的。由于离子交换法具有成本低、设备简单、不用或少用有机溶剂等优点,已成为提取抗生素的重要方法之一。

随着大网格聚合物吸附剂的合成和发展,吸附法重新为抗生素工业所重视而获得应用。吸附法具有操作简便、安全、设备简单、不用或少用有机溶剂、生产过程中PH变化小等优点。但吸附法选择性差,收率不高。常规吸附剂按其化学结构可分为两大类;一类是有机吸附剂,如活性炭、纤维素、大孔树脂等;另一类是无机吸剂,如氧化铝、硅胶、硅藻土、碳酸钙等。

沉淀法是利用抗生素在一定的PH条件下,与某些金属离子或其他化合物的整个分子结合成难易溶解的盐或复盐沉淀出来,以达到浓缩和提纯的目的。利用某些抗生素具有两极化合物的性质,使其在等电点时从水溶液中游离而沉淀出来,直接得到成品。根据抗生素的理化性质、提取工艺条件和所得沉淀物的情况,沉淀法一般可分为间接沉淀法和直接沉淀法两种类型。

溶剂萃取法按操作方式可以分为单级萃取和多级萃取,后者又可以分为错流萃取和逆流萃取。单级萃取只包括一个混合器和一个分离器。料液经萃取后的萃

取液再用新鲜萃取剂进行萃取称为多级错流萃取。溶剂萃取法提取青霉素的效果除了已选定已选定适当的有机溶剂、破乳化剂和离心分离设备外,还与PH、温度和萃取方式及浓缩比等因素有关。青霉素在酸性条件下极易被水解破坏,生成青霉素酸,但根据PK值的要求,又一定要在酸性时才能将青霉素转移到有机溶剂中,因此合适的PH很重要。在中性PH下青霉素以成盐的形式溶于水中,转移也较完全。如果碱性过强,则已发生碱性水解,而且杂质也易转到水相中,质量也较差。在低温条件下提取青霉素较为有利,并且提取过程中停留的时间越短越好。青霉素在丁酯中于0~15℃放置24h不致损失效价,但在温室下效价损失可达5.32﹪。萃取方式和浓缩比也有很大影响,根据萃取方式和理论收得率的计算得知,多级逆流萃取较理想,目前生产上采用二级逆流萃取方式。浓缩比的选择也很重要,因为丁酯的用量与收率和质量都有关系。若丁酯用量太多,虽然萃取较完全、收率高,但达不到结晶浓度要求,反而增加溶剂的耗用量;若丁酯用量太少,则萃取不完全,影响收率。

  六、抗生素的精制

1、浓缩

在抗生素提取和精制的过程中,常需要通过蒸发将发酵滤液或提取液进一步浓缩,以利于后序操作。抗生素生产中有真空浓缩和薄膜蒸发浓缩。

2、干燥

干燥的目的是除去抗生素中所含的水分,以提高产品的稳定性,有利于产品的加工、储存和使用。常用的干燥方法有减压干燥、喷雾干燥、气流干燥、冷冻干燥等。此外也有使用常压干燥、固定床干燥及红外线干燥等。

3、脱色和去热原

提炼往往是注射用抗生素提取中不可缺少的一个单元操作。这一步操作的好坏,不仅影响下一道工序,更重要的是关系到成品的色极及热原试验等质量指标。用活性碳可除去各种色素,同时也能出去热原。

4、结晶

抗生素的精制过程中常常通过结晶的方法来制得较高纯度的成品。抗生素的精制方法很多,生产中常用的结晶方法有以下几种:改变温度结晶、利用等电点结晶、加成盐剂结晶、加入不同溶剂结晶、共沸结晶。另外还有盐析法、中间盐转移法、晶体洗涤法等几种精制方法。重结晶是进一步提纯精制抗生素的有效方法,通过重结晶方法可获得高纯度抗生素产品。

  七、结论

发酵罐是现代微生物发酵技术的象征,它是微生物在发酵过程中生长、繁殖

和形成产品的外部环境装置,它取代了传统的发酵容器:培养瓶、酱缸和酒窖,它能实现大规模的生产,大限度地利用原料和设备,获得高产量和率。对青霉素生产的改进得益于来自于生物化学、遗传学、微生物生理学以及生化工程等方面科技人员的共同努力。迄今为止,人们对青霉素生物合成的了解还十分肤浅,大部分机理仍还无法阐述清楚,然而可以预计,随着对青霉素发酵过程和代谢途径认识的不断深入,人们一定能够找到某种适当的办法来解决青霉素合成中的阻遏因素,从而大幅度提高青霉素的效价和产量。青霉素的生产工艺

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